Celle/vevkultur

Click here for English

Døren inn til cellelabbene ved IBM skal alltid være lukket!

Prosedyrer for bruk av celle/vevskultur laboratorier

Hvert celle/vevskultur laboratorium har en romansvarlig og en brukeransvarlig. Den romansvarlige har overordnet ansvar for disponering av rommet og er også HMS ansvarlig. Brukeransvarlig har ansvar for opplæring av nye brukere samt å godkjenne cellelinjer og annet biologisk materiale som brukes. Den brukeransvarlige er også ansvarlig for oppfølging av HMS retningslinjer og at andre retningslinjer fra romansvarlig blir fulgt. Brukeransvarlig skal også ha ansvar for å sette opp ordensmannslister for hver enkelt cellelab.

Kun cellelinjer som er godkjent av brukeransvarlig kan dyrkes her, og det må under ingen omstendigheter bringes bakterier inn på cellelabben. Arbeid med godkjente virus krever egne arbeidsrutiner. Snakk med brukeransvarlig.

Klesskift

Slusen brukes til skift.

Alle må bruke frakker som er beregnet for cellelabben. Det er ikke tillatt å bruke vanlige laboratoriefrakker inne på cellelabben. Skitne frakker legges til vask hver 2. uke av ordensmann. Man skal også bruke spesialsko inne på cellelabben. Dersom skoene ligger og slenger utover rommet vil det ikke bli vasket der. Bruk skostativet.

LAF-benker (laminar air flow)

Viften må stå på 10-15 min før bruk. Husk å lukke luken til UV-lyset.

Benken vaskes med 70% EtOH både før og etter bruk. Ha så få gjenstander som mulig inne i benken under arbeid.

Søl fra medium bør først fjernes med vann og deretter vaskes vekk med 70% EtOH.

Etter bruk skal alt fjernes fra benken. Slå på UV-lyset.

Se egen bruksanvisning for LAF-benkene.

Hver 6. mnd. (juni + desember)

Vask/sterilisering av hele LAF-benken.

Ta ut benkeplatene og vask de med mildt såpevann. Skyll de godt med Milli-RO vann før de autoklaveres.
Vask innsiden av benken med mildt såpevann. Desinfiser deretter med 70% EtOH.
Vask "frontruten" på begge sider med såpevann og 70% EtOH.
Vask over alle utvendige flater med såpevann og 70% EtOH.

Om nødvendig kan hele LAF-benken pakkes inn og desinfiseres.

Mikrobølgeovn

Mikrobølgeovnen kan brukes til å sterilisere plast/engangsutstyr. Ha alltid med litt vann (i en beholder) for å unngå brann! Steriliser på full effekt i 2 minutter.

Etter bruk skal døren til mikrobølgeovnen stå åpen for å lufte ut fuktigheten og dermed unngå rustdannelse.

Søl inne i mikrobølgeovnen må vaskes med såpe og vann. Ha så 70% EtOH på litt papir og tørk over.

Aldri ha metall eller aluminiumsfolie i mikrobølgeovnen!

Inkubatorskap

Søl må tørkes opp med en gang! Vask først med vann, så med sprit. Det er ikke tillatt å tine medier o.l. i inkubatorskapene.

Alle har ansvar for påfylling av vann i beholderene (1 liter autoklavert Milli-RO vann tilsatt bakteriehemmende middel). Karene må holdes rene.

Vask og sterilisering av inkubatorskapene skal skje hver 6. måned.

Hver 6. mnd. (juni + desember)

Vask/sterilisering av skapene innvendig.
Vask alt innvendig med mildt såpevann. Skyll godt med Milli-RO vann og tørk over med 70% EtOH.
Autoklaver hyller, vegger, deksel i taket og skruer. Hvis skapet har en selv-steriliserings funksjon kan denne brukes i steden for autoklavering.
Etter sterilisering må CO₂ nivået i skapet kalibreres.

Hver 12. mnd.

Skift hepafilter, filter til gummigjennomføringen og filter til utgang for måling av gasskonsentrasjon.
Skift vann i vannkappen (~ 43,5 liter). Bruk klorfritt destillert vann.

Skuffer og hyller

Hylleskap og skuffer er fordelt mellom labbene. Skapdørene må lukkes for å unngå støv. Ikke oppbevar noe på gulvet eller oppå skapene. Det samler støv og gulvet blir ikke vasket.

Mikroskop

Husk å slå av mikroskopet etter bruk. Sett på hetten. For å spare pæren, skru ned lysintensiteten hvis mikroskopet skal stå på en stund. Opplæring av mikroskopet kan fåes av brukeransvarlig. Øyensverte kan lett skitne til okkularet.

Glassutstyr

Alt glassutstyr som skal brukes på cellelabben må steriliseres før bruk, enten i varmeskap (2 timer, 180ºC) eller ved tørr autoklavering.

Etter bruk skal utstyret skylles i slusen og settes til vask.

Mycoplasma testing

Alle cellelinjer som tines bør testes for mycoplasma. Celler som dyrkes over lengre tid bør testes hver 6. mnd.

Mycoplasma er de minste frittlevende selvreplikerende prokaryote organismene (0,2 - 2 µm i diameter) og infiserer mange ulike cellelinjer. De mangler cellevegg noe som gjør at antibiotika som virker på cellevegg dannelse (som f.eks. pencilin) ikke er effektive mot mycoplasma. En mycoplasma infeksjon kan være vanskelig å observere siden den ikke alltid forårsaker turbiditet i mediumet eller en pH forandring som er vanlig ved en bakterie eller sopp infeksjon.

En mycoplasma infeksjon kan gi langtids effekter:

Redusert vekst hastighet
Morfologiske forandringer
Kromosomale avvik
Forandringer i genekspresjon
Forandringer i aminosyre og nukleinsyre metabolismen
Forandringer i virus og antistoff produksjon

For å forhindre mycoplasma spredning bør alle cellekulturer sjekkes jevnlig.

Avfall

Når man jobber i LAF-benken skal alle medierester/cellerester/væske hives i en beholder med litt vann i bunnen. Når arbeidet er ferdig skal væsken helles i en glassflaske som står i slusen. Vask beholderen godt og steriliser den (med litt vann i bunn) i mikrobølgeovnen før den ryddes bort. Glassflasken med cellerester skal autoklaveres når den er full (minimum hver 2. uke). Etter autoklavering kan innholdet helles ut i vasken i slusen.

Hvis du bruker vakumpumpe for å fjerne brukt medium skal denne flasken tilsettes litt desinfeksjonsmiddel (f.eks. klorin) før den brukes. Dersom væsken kan autoklaveres uten å produsere gass gjøres dette som beskrevet over. Dersom væsken ikke kan autoklaveres pga gass dannelse, overføres den til en 10 L dunk (samme som brukes for farlig avfall), som er tilsatt desinfeksjonsmiddel (virkon). Når denne er full plasseres den i en gul boks, som avhendes som problemavfall.

Kast alt brukt engangsutsyr (som pipettespisser, plast pasteurpipetter, rør, o.l.) i kartong for spesialavfall (som står under LAF-benken). Når kartongen er full, pakkes den sammen og settes ut i slusen. Ordensmannen bærer den ned i avfallsrommet i 1. etg. Pasteurpipetter i glass kan også kastes i denne kartongen.

Papir kan kastes i vanlig bossbøtte.

Arbeid med godkjente virus krever egne arbeidsrutiner. Snakk med brukeransvarlig.

Kontaminerte cellekulturer helles i en ny glassflaske og autoklaveres øyeblikkelig! Hell litt såpe i celleflasken, skru igjen korken og kast den i kartong for spesialavfall.

Hvis du oppdager at cellene dine eller andres er kontaminert, gi beskjed til brukeransvarlig slik at han/hun kan ta de nødvendige forhåndsreglene!

Ordensmann

Alle som bruker cellelabben må være med å ta sin del av ordensmannsjobben. Ordensmannsjobben går over 2 uker.

Grunnregel: Alle skal til enhver tid rydde opp etter seg selv!

Annenhver uke:

Vask LAF-benkene innvendig med mildt såpevann. Vask også under benkeplatene. Tørk over med 70% EtOH.
Vask over med såpevann:
- Benker
- Inkubatorskapene utvendig
- På toppen av kjøleskapene/fryserene
- På toppen av skapene

Tørk over med 70% EtOH

Gulvet blir vasket av renholdspersonalet.

Sørg for at det er nok 70% vaskesprit
Send alle frakkene til vask
Skift vann i vannbadene
Autoklaver medie/celleavfall
Merk kartonger for spesialavfall med FORBRENNING eller VARMEDESINFEKSJON og sett de ned i bossrommet i 1. etg.

Denne filen skal leveres signert til brukeransvarlig!

Sikkerhetslaboratoriet (BSL3)

Ansvarlig: Bård Sværi (Tel. arb.: 55 58 68 32. Mobil.: 45 25 27 30)

For å få adgang til BSL3 laboratoriet kreves nøye gjennomgang av reglene sammen med trenet personale samt godkjenning av Bård Sværi.

Absolutt forbud

å gå inn i sikkerhetslaboratoriet uten hansker og skobytte eller skobeskyttelse.
å spise (inkludert tyggegummi), drikke eller røyke.
å arbeide med risikomateriale utenfor LAF-benkene. Dyrkningsflasker og ulik beholderer for risikomateriale må bare åpnes inne i LAF-benken.
For å redusere risiko for ulykker må en unngå å arbeide med glassutstyr samt stikkende og skjærende gjenstander og heller bruke plastmateriale.

Laboratoriebeskrivelse

Sikkerhetslaboratoriet er lokalisert i 6. etasje i bakre/søndre del av bygget ("ryggsekken"). Laboratoriet i Bygg for Biologiske Basalfag er oppført i overensstemmelse med gjeldende regler for ”Bio Safety Level 3” (BSL3) som er utarbeidet av NIH i USA og ACDP i England. Det er bygget for å tillate arbeid med meget potente smittestoffer.

Retningslinjer for det praktiske arbeidet er basert på mange års erfaring fra Karolinska Instituttet og Dana-Farber Cancer Institute.

Før du begynner å arbeide i sikkerhetslaboratoriet skal arbeidsforskriftene leses nøye, og du skal ha fått praktisk opplæring av autorisert person. Sikkerheten for deg og de som arbeider etter deg er avhengig av at alle følger sikkerhetsforskriftene.

Tekniske forhold

Laboratoriet består av to områder. Et indre laboratorieområde (=det sikre område) og et ytre område, som er den rene delen av slusen. Slusen utgjør altså overgangen mellom det rene område og det ”sikre område”. Slusedørene er utstyrt med elektronisk lås slik at begge dørene ikke kan åpnes samtidig.

Innenfor det sikre område er det et undertrykk på ca. 425m³ luft/time for å unngå at luft fra sikkerhetsområde trenger ut til det rene området utenfor. Dette undertrykket opprettholdes gjennom et ventilasjonssystem. Videre er vinduene i sikkerhetslaboratoriet og instrument rommet tette og kan ikke åpnes. De er utført i sikkerhetsglass for å hindre inntrengere.

Inne på BSL3 laboratoriet er det tre arbeidsplasser med hver sin ”Laminar Airflow” benk (LAF-benk klasse 2) hvor åpent arbeid med smittsomt materiale finner sted. Hver LAF-benk har 2 Hepa-filter, ett som filtrerer den sirkulerende luften i LAF-benken og et som filtrerer luft fra rommet og utgående luft fra LAF-benken. Luften fra øvrige deler av BSL3-laboratoret (instrumentrom, autoklavrom og slusen) filtreres gjennom et Hepa-filter i et eget system før den blåses ut fra taket. Avtrekksluften fra BSL3-laboratoriet er således fordelt på to separate system som ikke står i forbindelse med avtrekksluft fra øvrige deler av bygningen. Filtersystemene er dublerte slik at filterbytte kan foretas uten at arbeidet avbrytes. Videre finnes dobbel oppsetning vifter av sikkerhetsårsaker, og disse er koblet til bygningens nødstrømanlegg. En akustisk (lyd-) alarm er knyttet til BSL3-laboratoret og til den tekniske overvåkningen. Denne varsler når trykket blir feil i BSL3-området.

Ansvarshavende for BSL3 skal informeres når denne alarmen er utløst.

BBB Drift, Tel.: 55 58 62 50

På kveldstid: Bård Sværi, Tel.: 45 25 27 30

Laboratoriet er utstyrt med en gjennomgående autoklav for autoklavering av ”infisert” materiale før det blir kastet eller vasket. Vannet som skilles ut fra autoklaven varmes opp i et spiralsystem før det går ut i avløp. Vannet fra vasken går direkte ut i felles avløpet. Ved eventuelt behov kan dette samles opp i spesialtank for koking.

Feil eller ulykke

Alle uhell må rapporteres til Bård Sværi.

Ventilasjonen i BSL3-området skaper et undertrykk. Hvis det oppstår feil på ventilasjonen, lyder et signal. Åpne flasker eller rør med infeksiøst materiale må stenges og plasseres i inkubator innen du forlater laboratoriet.
Hvis en mindre brann oppstår, slukk den med CO2-slukker.
Ved større brann; forlat laboratoriet snarest etter at du har stengt åpne flasker og rør og kontrollert at CO2-inkubatoren, og fryser er lukket.
Ved søl av infeksiøst materiale i eller utenfor LAF-benken; tørk med papir dynket med Jodosan og kast dette i autoklavposen i den rustfrie beholderen i LAF-benken. Hell rikelig med Jodosan over området og la det virke i 10 minutter. Tørk så opp og kast denne i samme beholder.
Ved stikk eller kuttskader, eller søl direkte på huden, skyll umiddelbart under rennende vann, og vask med Jodosan. Ved blødning, la det blø en god stund under rennende vann.

Regler for servicepersonell/brannmenn til BSL3

For å gå inn i BSL3 området må skobeskyttelse og hansker tas på i slusen.
I tilfelle brann må ikke CO₂ - inkubatorer eller -80 °C fryseboks åpnes.

Prosedyrer for arbeid på sikkerhetslaboratoriet

Inngang til sikkerhetslaboratoriet

Gå inn i den første delen av slusen og steng døren
Ta av frakk og sko (ta eventuelt på skobeskyttelse av plast).
Ta på hansker og eventuelt munnbind.
Åpne døren til den ”infiserte” siden av slusen.(ytterdøren er nå elektronisk stengt).
Stig inn på gulvet innenfor den gule markeringen som er ”rent” område og ta på klogger som bare brukes på BSL3 området.
Lukk døren. Du er nå inne på BSL3 området hvor autoklavering foregår.
Ta på den gule frakken og dra opp hanskene over frakkens ermer så det blir tett.
Gå inn døren til BSL3 sikkerhetslaboratoriet hvor arbeid med høyrisiko materiale foregår.

Arbeid inne på BSL3 laboratoriet

Sett på LAF-benken, denne må stå på i 15 minutter før arbeid kan begynne (se instruksjoner for LAF-benk).
Dekk arbeidsflaten med absorberende papir. OBS! Ventilasjonshullene i benkeplaten må ikke tildekkes. Plasser en autoklavpose i metallbeholderen i LAF-benken til engangsmateriale som skal autoklaveres. Ha et lite beger eller lignende med Jodosan i LAF-benken for å skylle gjennom pipetter, spisse, rør, flasker etc. før de kastes i autoklavposen i metallbeholderen. Jodosan-begeret tømmes i ”waste”- flasken sammen med spisser og lignende etter avsluttet arbeid. Denne skrues igjen og når den er halvfull plasseres den i autoklavposen i metallbeholderen. Større mengder medium, PBS osv samles i gule bøtter som er fylt med ca.100ml desinfeksjonsvæske. Når denne er trekvart full settes den i et metallspann for autoklavering.
Ta på armbeskyttelse, ekstra plasthansker og plastforkle før arbeid i LAF-benken starter.
Doble hansker benyttes bare ved høy risiko materiale.
Alt materiale som tas ut fra LAF-benken ved avsluttet arbeid, sprayes med 70 % etanol.

Når arbeidet i LAF-benken er ferdig

Underlagspapiret kastes sammen med alt engangsmateriale i metallbeholderen, om det er tilsølt eller brukt i flere dager.
Vask LAF-benken med 70 % etanol.
Fjern ytterhanskene og kast dem i metallbeholderen. Plastforkle og armbeskytterne kan brukes på nytt. De kan henges opp og brukes ved neste anledning. Disse kastes i kartongen på gulvet når de er ferdig brukt.
Sett lokket på metallbeholderen om denne ikke er full. Når autoklavposen er full, brettes denne og lokket settes på metallbeholderen. Beholderen kan så settes under inkubatorskapet i vente på autoklavering. Bare autoklavposen går til autoklavering.
Slå av LAF-benken i følge instruksjoner.

NB! Det er ikke tillat å arbeide utenfor LAF-benken med dobbelt sett hansker som er brukt til arbeid inne i LAF-benken. Spray innerhanskene med 70 % etanol når du beveger deg andre steder i rommet, armbeskyttelse og plastforkle kan være på.

Når du forlater BSL3 laboratoriet

Ta av frakk, hansker kastes i kartongen i autoklavrommet.
Åpne døren til rent område (ytre sluse). Dørhåndtaket regnes som rent område og det er forbudt å ta i det med ”infiserte” hansker.
Stig ut av kloggene og gå over til den rene siden (innenfor den gule stripen) lukk døren.
Vask hendene før du forlater den ytre slusen.

Transport fra BSL3 området

Om virus eller infiserte celler skal fjernes fra laboratoriet (for eksempel for sending til andre laboratorier), skal alle flasker og rør skrues godt igjen og forsegles med parafilm rundt korken. Flasken må plasseres i en forseglet plastikkpose eller annen beholder (f.eks. isoporeske).
Spray på utsiden av pose/beholder med 70 % etanol før den forlater BSL3 området.
Prøver til p24 antigen eller revers transcriptase testing skal inaktiveres med triton X100, før de tas ut av rommet. Alle rør/plater som forlater BSL3 området må sprayes med 70 % etanol.
Instrumenter som skal flyttes for reparasjon må sprayes med 70 % etanol og om mulig plasseres i en ren plast pose.

Avfallshåndtering BSL3

Ikke-infeksiøst materiale

Papir, plast, kartonger og emballasje (for eksempel emballasje til engangspipettene, flasker og mikroplater) som ikke har vært i kontakt med infeksiøst materiale samles i en autoklaverbar plastsekk i kartong, som står på siden av hver LAF-benk. Når denne er full blir autoklavposen autoklavert og kastet.

Gule arbeidsfrakker samles i en autoklaverbar plastsekk og autoklaveres før de sendes til vask.

Infeksiøst materiale

Alt materiale som har vært i kontakt med infeksiøst agens legges i autoklavposen i den rustfrie beholderen (i LAF-benken) for autoklavering. Dette gjelder plastmateriale, blodrør, absorberende benkepapir samt det ekstra paret plasthansker. Pipetter, spisser, rør, flasker etc. skylles gjennom med Jodosan eller Virkon før de kastes i beholderen. Mindre mengder væske helles i tomme mediumflasker m/ca. 100ml 5% SDS eller Virkon, skift denne når den er halvfull (tomme flasker står i indre slusen), skru korken på og sett denne ned i autoklavposen som er i metallbeholderen. Større mengde væske helles i den gule bøtten som har ca. 100 ml 5% SDS eller Virkon. Når denne er trekvart full, settes den i en metallbøtte til autoklavering.

LAF-benker i cellelaboratoriene

Hovedtyper av LAF- benker:

1. Sterilbenker

A. Horisontal

B. Vertikal - Pga luftstrømmen

2. Sikkerhetsbenker

Klasse I	Operatørbeskyttende, turbulent luft, fare for krysskontaminasjon av produktet
Klasse II	Produkt og operatørbeskyttende, laminær luftstrøm, resirkulering av luft
Klasse III	Operatørbeskyttende, hanskeboks

Sikkerhetsbenker klasse II

Institutt for biomedisin har klasse II sikkehetsbenker, type Maxi safe 2010 fra Medinor.

Vi har både sikkerhetsbenker med 2 filter som brukes til ”vanlig” celledyrking og benker med 3 filter som er spesielt egnet for ekstra farlige mikroorganismer og i P3 laboratorium. Dette ekstra HEPA filteret ligger rett under bordplaten, mens de to andre er plassert i toppen. Det innerste i innertaket på skapet, gir en uniform luftstrøm.

HEPA filteret renser luften; 99,9997% av partikler størrelse 0,3 µ i diameter.

Skift av filter gjøres av fagmann, varighet på 7-8 år, men bør testes av fagmann hvert år.

Luften blir tatt inn i fronten av benken og ned i det første HEPA-filteret. Luften går gjennom benken og ned gjennom et nytt HEPA-filer i taket av benkeplaten. Luften kommer ovenfra og ned, en laminær luftstrøm, som krever like stor skråning på bakvegg og front og lufthastigheten inn i front er 0,4 m/s. Luften går ned i hjørnet innerst i skapet og ved fronten. Her blir luften (både innenfra og utenfra) trukket ned og går gjennom første filter igjen. 25% av luften blir avkast (går ut), 75% av luften blir resirkulert.

Det er et negativt trykkammer (undertrykk) i benken som hindrer lekkasje til omgivelsene.

Rengjøring

Med jevne mellomrom (~en gang i uka) må benken vaskes innvendig med mildt såpevann (Zalo), bruk renroms-klut (Aet, Puls) for å unngå ekstra partikler. Benkeplatene kan enkelt løftes opp så man kommer til under.

Benken desinfiseres deretter med 70% sprit. Benkeplatene kan autoklaveres.

NB! Fuktighet må ikke trenge inn til HEPA-filteret i taket, eller HEPA-filteret under bordet.

HEPA-filteret i bunnen tåler litt fuktighet men vær forsiktig med søl.

UV-lys

UV-lys er plassert i LAF-benken slik at det er kort avstand til overflaten. Det sender ut UVC stråler med bølgelengde 254 nm og man trenger bare 15-20 min eksponering. Glasset i fronten stopper UV-strålene og må være helt nede før lyset slåes på.

Arbeidsrutiner

Benken skal være på i minst 10 min før arbeidet startes opp.
Sett alt du trenger for sterilarbeid inn i benken ved oppstart, men færrest mulig gjenstander settes inn (vurderes selvfølgelig opp mot mengde håndtering ut og inn av benken).
Hånd og armbevegelser skal være langsomme.
Hendene må plasseres mellom luftstrømmen og sterilt objekt, armene skal ikke dekke luftehullene (perforeringen).
Frontruten må være i arbeidsposisjon under arbeidet (man får ellers alarm). Løft aldri frontvinduet manuelt!
Luften er ikke-laminær nærmest åpningen (turbulens), så det må arbeides minst 15 cm inn i benken (innenfor perforeringen).
Arbeidet må alltid utføres med benken på full hastighet.
Unngå ferdsel fram og tilbake bak en som jobber i LAF-benken, og unngå åpent vindu, dette lager også ekstra turbulens.

NB! Vær oppmerksom på turbulensproblemet. Turbulens dannes bak alt som skygger for luftstrømmen. Unngå å sette sterile prøver i turbulenssoner. Plassèr ting på sidene i avtrekket og husk å slå ned UV-lys klaffen.

OBS! Unngå brennere! Hvis det må brukes, bruk “safety burners”.

Bruksanvisning

1. Sett front-vinduet i arbeidsposisjon (opp) (10) (hold knappen inne)
2. Slå på lyset (4)
3. Slå på viften på fullt (1), sett ditt utstyr (NB! Rene ting) inn i benken og la viften gå i 15 min før du starter steril-arbeidet
4. Etter at steril-arbeidet er utført, fjern alt fra benken. Tørk av ev. søl og rengjør benken med 70% sprit. La viften gå i 10 min etter rengjøring
5. Slå deretter av viften (1), slå av lyset (4), lukk opp UV-lys luken og senk front-vinduet helt ned (11) (Hold knappen inne en stund)
6. Slå på UV-lyset (3), UV-lyset blir automatisk avslått etter 20 min (timer som kan reguleres)

HEPA-filter i taket tåler ikke fukt, støt og varme. Vær forsiktig!

Unngå søl i HEPA-filter under benk.